RNA抽取實驗及注意事項
RNA抽取主要使用TRIzoI抽提法,TRIzoI主要用于裂解細(xì)胞,使細(xì)胞中的蛋白核酸物質(zhì)得到釋放。改進(jìn)試劑盒抽屜方法,在樣品加入裂解液后,通過高速離心總RNA在高離序鹽狀態(tài)下選著吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜上,通過一系列快速漂洗離心。去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除,最后低鹽的RNase-freeH20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
注意事項:
RNA不穩(wěn)定、容易被降解或污染,因此在進(jìn)行RNA實驗時,要保持環(huán)境的清潔。RNA樣品制備好應(yīng)儲存在-80℃,盡量避免反復(fù)凍融。使用RNA樣品時、應(yīng)在冰上操作。
預(yù)防RNase污染、注意以下幾點
1.經(jīng)常更換新手套,皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌、可能導(dǎo)致RNase污染。
2.使用無RNase的塑料制品避免交叉污染。
3.RNA在裂解液RL中時不時會被RNase降解。提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)該使用不含RNase的塑料盒玻璃器具。玻璃器具可在150℃烘烤4小時,塑料器具可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘,清水徹底洗凈、滅菌可除去RNase。
5.配置溶液應(yīng)使用RNase-Free ddH20(將水加入到干凈的玻璃瓶中,加入DEPC至濃度0.1%(V/V)混勻放置過夜、高壓滅菌。)
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