二硫鍵，又稱S?S鍵，是2個巰基被氧化而形成的?S?S?形式的硫原子間的共價鍵，在蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)形成上起著一定的重要作用。為了確定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，首先必須將二硫鍵打開，使之成為線狀多肽鏈。DTT和TCEP是常用的還原二硫鍵的試劑，那二者在使用中有什么不同呢？
 
DTT中文名稱為二硫代蘇糖醇，是蘇糖醇的C-1及C-4位羥基置換成巰基的化合物，常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。
 
DTT有兩個巰基基團，其作用能維持3~7天，揮發(fā)性不強，使用時可以直接加入到懸滴中去，或通過微透析的方法加入。但DTT往往無法還原包埋于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部（溶劑不可及）的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質(zhì)變性（高溫加熱或加入變性劑，如鹽酸胍、尿素或SDS）。反之，根據(jù)DTT存在情況下，二硫鍵還原速度的不同，可以判斷其包埋程度的深淺。另外，DTT可以使Ni被還原，因此在用Ni柱純化帶有His標簽的蛋白時要避免使用DTT，而應(yīng)該考慮TECP。
 
二硫鍵的斷裂通常需要有大量的自由巰基和二硫鍵交換，三價膦系衍生物由于其較強的還原能力和對二硫鍵的選擇還原性得到很多研究者的青睞。這類還原劑的還原是一個定量反應(yīng)的過程，其原理是其中心原子“P”所帶的孤電子對能與氧原子形成配位共價結(jié)合而具有還原性。如下式所示:
 
TCEP，三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽，是三價磷系衍生物中作用最優(yōu)的。它是一種無色、無味、易溶于水的弱還原性物質(zhì)，在水中溶解度能達到310mg/mL。其在空氣和水溶液中具有較高的穩(wěn)定性，受溫度和濃度的影響小。TCEP是一種極為合適的部分還原試劑，對還原二硫鍵選擇性極強，除半胱氨酸外，幾乎沒有與其它氨基酸的副反應(yīng)，并且能在更寬的pH值范圍包括酸性條件(pH值3)下使用，從而有效減少酰胺鍵的水解。TCEP的反應(yīng)活性溫和、易溶、毒性小，且更容易操作，在酸性、堿性溶液中的穩(wěn)定性都很好。而且還原能力比DTT強，它的作用可以維持2~3周，是公認的DTT(二硫代蘇糖醇)的一種良好替代物。
 
DTT(二硫代蘇糖醇)和TCEP（三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽）可以相互代替，只是效果不同而已。與DTT相比，TECP還原能力更強，更具有選擇性；無論在酸性還是堿性條件下都更加穩(wěn)定；本身不帶有電荷，不影響后續(xù)的實驗。TCEP不僅是一種高效的二硫鍵還原劑，而且在某些巰基的交聯(lián)反應(yīng)中不需要除掉，因而在蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究常常優(yōu)先選擇TCEP。
 
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